Réaliser des analyses au laboratoire de microbiologie

Un milieu de culture permet la multiplication d’un micro-organisme parce que sa composition est adaptée à ses exigences nutritives. Il est obtenu en ajoutant à de l’eau distillée, différents composés chimiques organiques (molécules contenant des atomes de carbone, d’hydrogène, d’oxygène, d’azote, etc.) ou inorganiques (ion). 

La composition d’un milieu de culture est très variable et dépend des objectifs de l’activité (isolement, enrichissement, sélection, etc.) et des besoins du micro-organisme étudié. 

Un milieu empirique est un milieu dont la composition est connue approximativement notamment en raison de la présence de substances complexes telles que des hydrolysats de levure, des peptones, des extraits de viande, etc.

Un milieu synthétique est un milieu de culture dont la composition est connue précisément de manière qualitative et quantitative. 

Un milieu sélectif favorise la croissance de certains micro-organismes en inhibant les autres. Il peut être obtenu par ajout d’antibiotiques. 

Un milieu différentiel permet de distinguer, par observation des colonies ou de changements de couleur du milieu, au moins deux types de micro-organismes qui se développent au sein de la gélose.  

Réaliser un isolement consiste à séparer les micro-organismes d’un échantillon en dispersant les cellules à la surface d’un milieu nutritif gélosé. La méthode permet d’épuiser la suspension et d’isoler les micro-organismes les uns des autres (méthode des quadrants, etc.). Après incubation, chaque micro-organisme déposé à la surface de la gélose, s’est multiplié à l’identique formant un petit amas bien distinct, visible à l’œil nu : une colonie. 

L’étude macroscopique d’une colonie passe par la description, à l’œil nu, de la taille de la colonie, sa couleur, son relief, ses contours, sa transparence et sa consistance.

Si un seul type de colonie est observé, la souche est pure. 

Par sa composition, un milieu de culture apporte un pH optimal à la croissance du micro-organisme. La température d’incubation des milieux doit être également rigoureusement choisie en fonction du micro-organisme. 

Identifier une bactérie consiste à lui attribuer un nom de famille, de genre et d’espèce. Pour identifier une bactérie, plusieurs manipulations sont nécessaires.

La coloration de Gram consiste, dans un premier temps, à réaliser un frottis séché fixé, et dans un second temps, de le colorer au violet de gentiane. Le passage dans le lugol renforce la coloration chez certaines bactéries. La préparation est ensuite trempée dans un mélange alcool acétone et suivie d’une contre-coloration à la safranine ou fuschine. Elle permet d’observer la morphologie des cellules (taille, forme), leur mode de groupement, leur couleur. 

Préparer un état frais consiste à réaliser une préparation microscopique entre lame et lamelle d’une suspension contenant des micro-organismes vivants. Il permet d’observer la morphologie des cellules (taille, forme), leur mode de groupement et l’éventuelle mobilité. 

La recherche de l’oxydase présente un intérêt taxonomique pour les bactéries à Gram négatif. L’oxydase est une enzyme de la chaîne respiratoire. Le test consiste à mettre en évidence la capacité de l’enzyme à catalyser l’oxydation d’un substrat synthétique incolore en un produit coloré rose violacé.   

La recherche de la catalase présente un intérêt taxonomique pour les bactéries à Gram positif. Celles qui possèdent cette enzyme catalysent la dégradation du peroxyde d’hydrogène en dioxygène et en eau. 

Ces deux tests enzymatiques marquent, avec la coloration de Gram, le départ de l’identification bactérienne. 

Le comportement d’une souche bactérienne vis-à-vis du dioxygène définit son type respiratoire. Certains micro-organismes nécessitent la présence de dioxygène pour leur croissance alors que pour d’autres, il est toxique ou les bactéries y sont indifférentes. La gélose viande foie VF est le milieu utilisé pour mettre en évidence le type respiratoire. 

D’autres tests biochimiques sont réalisés soit en macrogalerie soit en microgalerie. Les résultats seront interprétés à l’aide d’une clé dichotomique ou par bio-informatique. 

Réaliser un dénombrement consiste à déterminer le nombre de micro-organismes par unité de masse ou de volume d’un échantillon. Le résultat obtenu est une concentration en nombre de cellules notées :

c_{N (micro-organismes ; échantillon).}

Le dénombrement peut être réalisé :

• Par une méthode indirecte, en milieu solide : le principe repose sur la détermination du nombre de colonies formées à la surface de la gélose après inoculation (en masse ou en surface) d’un volume défini d’inoculum. Après incubation, chaque micro-organisme donnera une colonie visible à l’œil nu. Le nombre de colonies traduit le nombre de micro-organismes présents initialement dans le volume inoculé. Le résultat est exprimé en unités formant des colonies (UFC). Si l’échantillon à analyser est trop concentré en micro-organismes, il est nécessaire de réaliser des dilutions décimales.
• Par une méthode directe : le principe repose sur la détermination du nombre de cellules présentes dans un volume de suspension exactement connu (chambre de comptage) à l’aide du microscope et d’un cytomètre. Ce dernier se positionne sur la platine du microscope, les cellules sont comptées directement. Le choix du cytomètre dépend de la taille du micro-organisme. Il est possible de distinguer les cellules mortes des cellules vivantes (pourcentage de viabilité) en utilisant le bleu de méthylène de Funk.
• Par filtration sur membrane : cette technique est utilisée pour des volumes d’inoculum > 10 mL. La filtration stérilisante consiste à faire passer le liquide à travers une membrane dont les pores ont une taille inférieure à celle des micro-organismes. 

Réduire la charge microbienne vise à diminuer le nombre de micro-organismes dans un échantillon ou sur une surface. Deux effets sont possibles : microbicide en détruisant les biomolécules pour entraîner la mort cellulaire ou microbiostatique en modifiant la structure et/ou le fonctionnement des biomolécules pour ralentir ou arrêter le métabolisme cellulaire. Plusieurs techniques peuvent être appliquées dans les divers domaines (bio-industrie, santé, etc.). Les traitements thermiques de réduction de charge microbienne les plus connus sont la pasteurisation, la stérilisation. 

Parmi les techniques de nature physique, plusieurs peuvent être mises en œuvre : par la chaleur (humide ou sèche), par les radiations (UV, etc.), par filtration, etc.

Pour contrôler l’efficacité des traitements thermiques, des courbes de destruction thermique des micro-organismes sont réalisées : 

c_{N (micro-organismes ; produit)} = f _(temps).

La courbe est de type exponentiel. L’exploitation se fait par une représentation semi-logarithmique. Elle permet de déterminer un des paramètres de thermorésistance : le temps de réduction décimale (D). La mise en œuvre du traitement dépendra du couple température/durée du traitement (appelé barème). 

Le temps de réduction décimale correspond au temps nécessaire pour tuer 90 % des micro-organismes d’une population dans un échantillon donné à une température spécifique. 

D’un point de vue chimique, il existe trois grands types d’agents qui permettent de réduire la charge microbienne : les désinfectants, les antiseptiques et les antibiotiques.

Un désinfectant s’applique sur un milieu inerte (surfaces, locaux, etc.) à la différence d’un antiseptique qui s’applique sur les tissus vivants (peau, muqueuse, etc.). Le spectre d’activité d’un désinfectant ou d’un antiseptique correspond à l’ensemble des micro-organismes sur lequel il agit. 

Un antibiotique est une substance naturelle ou synthétique. Il détruit les micro-organismes ou inhibe leur croissance à des concentrations suffisamment faibles pour ne pas être toxiques pour l’hôte. Il existe trois principaux modes d’action des antibiotiques : 

• L’inhibition de la synthèse de la paroi ;
• L’inhibition de la synthèse des protéines ;
• L’inhibition de la synthèse des acides nucléiques.

Les bactéries peuvent résister aux antibiotiques grâce à diverses adaptations : altérer la cible de l’antibiotique, dégrader l’antibiotique, le modifier ou le rejeter rapidement.