Réaliser des analyses au laboratoire de biologie moléculaire des acides nucléiques

L’extraction de l’ADN bactérien peut être réalisée par lyse alcaline. Elle nécessite l’utilisation de plusieurs solutions de : 

• Lysozyme : cette enzyme va dégrader le peptidoglycane en hydrolysant les liaisons ß (1 – 4) du peptidoglycane. 
• SDS, détergent anionique : il déstabilise la membrane cytoplasmique. 
• Saccharose : il évite la lyse cellulaire. 
• EDTA, chélateur de cations bivalents : il protège les acides nucléiques. 
• Tampon TRIS : il permet de maintenir le pH du milieu réactionnel.
• Protéases : elles hydrolysent les protéines.
• Perchlorate de sodium : il élimine les protéines par modification de la force ionique. 
• Chloroforme/alcool : ce mélange sépare les acides nucléiques des protéines dénaturées. 
• Éthanol à froid : son rôle est de précipiter l’ADN. 
• Ribonucléases : elles dégradent les ARN.  

D’autres techniques peuvent être utilisées :

• La séparation magnétique : elle est basée sur l’établissement de liaisons réversibles de l’ADN à une surface solide (particules magnétiques recouvertes d’un anticorps liant l’ADN ou d’un groupement fonctionnel interagissant spécifiquement avec l’ADN). 
• Sur colonne utilisant la silice : l’ADN s’adsorbe spécifiquement sur des particules de silice. L’élimination des contaminants cellulaires est réalisée par différentes étapes de lavage. Elles sont suivies par une étape d’élution de l’ADN.

Le contrôle qualité de l’extraction est réalisé en mesurant les absorbances à 260 nm et à 280 nm. La première longueur d’onde reflète la présence des bases azotées hétérocycliques et la seconde, les protéines. Il suffit de déterminer le rapport :

A_{260 nm}/A_{280 nm}.

L’amplification spécifique d’une séquence nucléique peut être réalisée par PCR (réaction de polymérisation en chaîne). Elle permet d’obtenir à partir d’un échantillon peu abondant des quantités importantes d’un fragment d’ADN spécifique et de longueur définie. 

La PCR se réalise en plusieurs cycles (n) qui se déroulent en plusieurs étapes :

• Étape 1. La dénaturation : elle consiste à séparer les deux brins de l’ADN par rupture des liaisons hydrogène. Elle se déroule à une température aux alentours de 94 °C. 
• Étape 2. L’hybridation : elle consiste à apporter les amorces indispensables au démarrage de la polymérisation. Cette étape se réalise à une température comprise entre 50 °C et 65 °C selon les amorces. 
• Étape 3. L’élongation : elle consiste à recopier l’ADN matriciel grâce à une enzyme : souvent la Taq polymérase qui travaille à 72 °C. 

Ce cycle est répété plusieurs fois. La quantité d’amplicons formés peut être estimée avec la formule : N = N₀ × 2 ⁿ avec n, le nombre de cycles, N₀ la quantité d’ADN initiale. 

Il existe des techniques dérivées dont la :

• q-PCR : c’est une PCR quantitative. Elle permet de quantifier les amplicons formés en temps réel. 
• RT-qPCR : c’est une rétro-transcriptase-qPCR. Elle permet de réaliser une PCR à partir d’ARN. 

L’électrophorèse en gel d’agarose est une méthode d’analyse et de fractionnement qui permet de séparer des molécules au travers d’un gel d’agarose. Elle peut être utilisée en génétique pour vérifier la qualité d’une amplification par PCR. 

L’agarose forme, en fonction de sa concentration, un réseau de mailles plus ou moins serrées. Les fragments d’acides nucléiques étant chargés négativement en raison des groupements phosphoryles, ils migreront tous vers l’anode. La migration différentielle sera basée sur la taille des fragments donc leurs poids moléculaires. Les fragments de hauts poids moléculaires migreront peu et les fragments de faibles poids moléculaires migreront plus loin. 

Grâce à marqueur de poids, il est donc possible de :

• Réaliser une estimation de la taille des fragments en les comparant entre eux ;
• Déterminer précisément la taille des fragments par régression linéaire.

Un tampon de charge est généralement mélangé aux échantillons afin d’éviter les contaminations des puits lors des dépôts sous-marins. 

Un révélateur permet de mettre en évidence les bandes obtenues.