Réaliser des analyses au laboratoire de biologie cellulaire

Les techniques de culture in vitro permettent d’obtenir des cultures réalisées sur milieu synthétique, dans des conditions stériles, dans un environnement contrôlé et dans un espace réduit. 

Le milieu synthétique doit être adapté à la technique. Il est composé d’eau, de macro-éléments, de micro-éléments (sels minéraux), de substances de croissance, d’agents gélifiants (pour la texture du milieu). 

Du sérum de veau fœtal est ajouté afin d’apporter des nutriments organiques supplémentaires comme des médiateurs extracellulaires, des facteurs d’adhérence, des facteurs de croissance, etc. Des antibiotiques sont également ajoutés afin d’éviter les contaminations bactériennes ou des antifongiques sont apportés pour lutter contre le développement de moisissures. 

La L-glutamine est un acide aminé qui joue un rôle important dans le cycle de Krebs. Il est ajouté extemporanément au milieu afin d’éviter sa dégradation. 

Les conditions stériles sont obtenues en travaillant dans un environnement stérile sous hotte à flux laminaire horizontal. Les conditions de température et de pH sont contrôlées. 

La trypsination en culture cellulaire est une étape qui consiste à ajouter de la trypsine, une sérine protéase. Cette enzyme clive les résidus de lysine et d’arginine au niveau de l’extrémité C terminale des protéines. Cette enzyme protéolytique digère la trame protéique qui entoure les cellules. Ce qui provoque leur détachement par rupture des interactions cellules-cellules et cellules-support. 

L’EDTA est un chélateur de cations bivalents. Il est ajouté en culture cellulaire afin de se complexer à certains ions (calcium, magnésium, etc.) puisque ces ions inhibent l’action de la trypsine. L’EDTA facilite donc le décollement cellulaire.   

Réaliser des contrôles qualité des cultures cellulaires in vitro est indispensable pour vérifier la santé des cellules. La surveillance régulière est réalisée en observant la croissance des cellules, leur morphologie et la viabilité des cellules. Il est également important de maintenir les conditions optimales de culture d’où l’importance de contrôler l’absence de contamination. 

Le contrôle de la contamination bactérienne, fongique et virale passe par des tests réguliers de l’efficacité du système tampon grâce notamment aux indicateurs colorés de pH présents dans les milieux de culture. 

Le suivi de la viabilité des cultures cellulaires peut être réalisé par :

• Le test MTT (bromure de 3, 4, 5 diméthylthiazol-2-yl-2, 5-diphényltétrazolium) : ce réactif est réduit par les cellules vivantes (présence d’une enzyme mitochondriale). Du sel de formazan coloré en bleu se forme. L’intensité de la coloration est mesurée par spectrophotométrie. L’absorbance est proportionnelle au nombre de cellules viables. 
• Le cytomètre de Malassez : le principe repose sur la détermination du nombre de cellules présentes dans un volume de suspension exactement connu (chambre de comptage) à l’aide d’un microscope et d’un cytomètre. Il est possible de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes en les diluant avec du bleu trypan. Les cellules mortes sont incapables d’expulser le bleu. Ce dernier reste dans le cytoplasme et les cellules mortes apparaissent bleutées. Les cellules vivantes sont incolores. 
•  L’utilisation de colorants (Annexine V ou iodure de propidium) pour détecter les cellules apoptotiques.