Réaliser des analyses au laboratoire de biochimie analytique

Doser une biomolécule en solution peut être réalisée par spectrophotométrie d’absorption moléculaire. 

Le principe du dosage est basé sur la loi de Beer-Lambert. 

Lorsqu’un faisceau monochromatique d’intensité I₀ traverse une cuve contenant une solution colorée, une partie de la lumière incidente est absorbée. Le faisceau émis est plus faible. L’absorbance est proportionnelle à la concentration de la solution :

• A, absorbance du chromophore à la longueur d’onde optimale (sans unité) ;
• ε, coefficient d’absorbance linéique molaire du chromophore à sa longueur d’onde optimale (L/mol/cm) ;
• l, longueur du trajet optique (cm) ;
• c, concentration du chromophore dans la solution analysée (mol/L).

La formule associée à la loi de Beer-Lambert :

                                                         A = ε × l × c.

Les conditions de la loi de Beer Lambert sont validées si :

• La solution est limpide. 
• La longueur d’onde de mesure est optimale. 
• L’absorbance de l’échantillon se situe dans la zone de linéarité. 

L’appareil de mesure est un spectrophotomètre. Il est nécessaire de réaliser l’ajustage de l’appareil de mesure à l’aide d’un témoin réactif, contre l’air ou de l’eau distillée. La longueur d’onde est réglée à la longueur d’onde maximale d’absorbance déterminée préalablement par un spectre d’absorption. 

L’exploitation des valeurs mesurées peut être réalisée soit :

• En appliquant la loi de Beer-Lambert si l’on connaît le coefficient d’absorbance linéique molaire de la biomolécule. 
• En comparant avec une solution étalon dont on connaît la concentration de l’étalon. 
• En exploitant les valeurs obtenues d’une gamme d’étalonnage de solutions de concentrations connues.

Il est parfois nécessaire de diluer l’échantillon. 

Les dosages de substrat par méthode enzymatique permettent de déterminer la concentration d’un composé dans un échantillon. On mesure la quantité de substrat transformé ou de produit apparu par spectrophotométrie. Généralement, la réaction principale est couplée à une réaction indicatrice. 

Plusieurs conditions sont nécessaires : 

• La concentration en substrat doit être inférieure à celle en enzyme. C’est un facteur limitant. 
• La concentration en enzyme doit être suffisante afin d’assurer le temps de contact avec le substrat. 
• La température doit être optimale et maintenue constante grâce à des bains thermostatés. 
• Le pH doit être optimal et maintenu constant grâce à des solutions tampons. 

Il existe deux types de méthodes :

• Cinétique : la vitesse de la réaction est proportionnelle à la concentration en substrat. On mesure les variations d’absorbance pendant un temps court. 
• En point final : on dose l’un des produits apparus (NADPH,H+ par exemple) ou sa disparition après transformation totale du substrat. 

Il est donc important de respecter le temps d’incubation. 

Les enzymes sont caractérisées par deux paramètres cinétiques : 

• V_max, qui correspond à la catabilité de l’enzyme, c’est-à-dire sa capacité à transformer une quantité donnée en substrat pendant un temps donné. Son unité est le Katal (mol/seconde). 
• K_M, qui reflète l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Son unité est mol/L de milieu réactionnel.

La représentation de Michaëlis Menten permet d’estimer ces paramètres : 

V_max = f (c_substrat).

D’autres représentations permettent de déterminer précisément les paramètres cinétiques. La représentation de Lineweaver-Burk dite en double inverse :

1/V_max = f (1/c_substrat).

Les paramètres cinétiques d’une enzyme peuvent être déterminés par deux méthodes : deux points ou cinétique. Le choix d’une méthode particulière dépendra de l’objectif du dosage enzymatique, l’applicabilité de la méthode, accès à l’équipement nécessaire pour mener l’expérience, le coût d’utilisation d’une méthode particulière… 

Les conditions expérimentales pour déterminer l’activité enzymatique doivent être respectées : 

• Enzyme à doser présente en quantité limitante ;   
• Concentration en substrat saturante ; c_substrat > 10 K_M ; 
• pH fixé par une solution tampon (pH optimal et constant) ; 
• Température fixée d’une manière précise et constante (bain thermostaté) ; 
• Force ionique fixée par une solution tampon ; 
• Présence d’effecteurs (méthodes optimisées).

La chromatographie est une méthode d’analyse et de fractionnement qui sépare les solutés d’un mélange par entraînement au moyen d’une phase mobile (liquide ou gaz) le long d’une phase stationnaire (solide ou liquide fixé) grâce à la répartition sélective des solutés entre ces deux phases. Le soluté est soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile). 

Il existe différents types de chromatographie :

• De partage : c’est une chromatographie liquide-liquide. La phase de stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte. 
• D'adsorption : c’est une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire est de nature solide. 

Plusieurs types de chromatographies sont possibles selon les critères de séparation :

• Chromatographie d’affinité : elle est basée sur la complémentarité entre deux molécules (antigène-anticorps, enzyme-substrat, etc.).
• Chromatographie gel filtration : elle permet de séparer des molécules en fonction de leur taille. 
• Chromatographie échangeur d’ions : la phase de stationnaire est une résine contenant des groupements chargés associés à des contre-ions échangeables. On distingue des résines échangeuses de cations et d’anions. Elle permet de séparer les molécules en fonction de leur charge. 
• Chromatographie en phase gaz CPG : la phase mobile est gazeuse. Les solutés sont détectés en sortie de colonnes et caractérisés par des pics. 
• Chromatographie liquide à haute performance HPLC : les solutés sont séparés, sur colonne, par passage sur une phase stationnaire sous pression grâce à une phase mobile composée d’un ou plusieurs solvants. 
• Chromatographie sur couche mince CCM : elle permet de qualifier un mélange de solutés par comparaison des rapports frontaux obtenus pour les témoins.